Fleming 1928-ban tette nagy felfedezését. A laboratóriumában található egyik Staphylococcus baktériumkultúrát levegő érte, és megpenészedett. Fleming észrevette, hogy a tenyészetnek az a része, amely közvetlenül körülvette a penészt, feloldódott. Ebből helyesen arra következtetett, hogy a penész olyan anyagot termelt, amely mérgező volt a Staphylococcus baktériumra.

Hamarosan azt is sikerült kimutatnia, hogy ugyanez az anyag sok más káros baktériumfajta növekedését is meggátolta.

Az anyag, melyet penicillinnek nevezett el a penész (penicillium notatum) után, amely termelte, nem volt mérgező emberre és állatra sem. Fleming 1929-ben publikálta eredményeit, de először nem nagyon figyeltek fel rájuk.

Rámutatott, hogy a penicillin fontos lehetne az orvosi gyakorlatban. Neki magának azonban nem sikerült kidolgoznia az eljárást a penicillin kiválasztására, és a csodálatos szert ezért még több mint tíz évig nem használták.

Végül a harmincas évek vége felé két kutatóorvos, Howard Walter Florey és Ernst Boris Chain rábukkantak Fleming cikkére. Megismételték a kísérletet, amely igazolta eredményeit. Aztán penicillint választottak ki, és kísérleti állatokon próbálták ki az anyagot. 1941-ben beteg embereken is alkalmazták a penicillint.

A vizsgálatok világosan kimutatták, hogy az új szer meghökkentően hatásos. A brit és az amerikai kormány biztatására gyógyszerészeti vállalatok is bekapcsolódtak a kutatásba, és hamarosan kifejlesztették az eljárást, amellyel nagy mennyiségben tudtak penicillint előállítani.

A penicillint először csak háborús sebesülésekkor alkalmazták, de 1944-re a brit és az amerikai polgári lakosság kezelésére is megfelelő mennyiséggel rendelkeztek. 1945-ben, amikor a háború véget ért, a penicillin használata az egész világon elterjedt.

A penicillin felfedezése nagyban elősegítette más antibiotikumok kutatását is, ami sok egyéb "csodaszer" felfedezését eredményezte. A leggyakrabban használt antibiotikum azonban a penicillin maradt.

Folyamatos népszerűségének az oka, hogy a penicillin nagyon sokféle mikroorganizmus ellen hatásos. A szer eredményesen használható a szifilisz, gonorrhoea, skarlát és diftéria kezelésére, valamint bizonyosfajta ízületi gyulladások, hörghurut, agyhártyagyulladás, vérmérgezés, kelések, csontfertőzések, tüdőgyulladás, fekély és még sok más betegség esetében is.

A penicillin másik nagy előnye, hogy használata elég biztonságos. 50000 adag penicillin már hatásos bizonyos fertőzések ellen: de napi 100 millió egységnyit is fecskendeztek már be betegnek káros mellékhatások nélkül. Noha az emberek egy kis százaléka allergiás a penicillinre, a legtöbb ember esetében a szer hatásos és egyben biztonságos is.